宏基因组测序进临床？得先克服这4大障碍

这是《肠道产业》第 964 篇文章

编者按

随着核酸测序成本的降低和技术的飞速发展，宏基因组测序有望进入临床应用。除了研究人体微生物组，宏基因组测序的应用正在改变医生诊断和治疗疾病的方式。那么当前宏基因组测序面临着哪些问题？未来又该如何发展呢？

今天，我们共同关注宏基因组测序在临床中的应用，希望本文能够为产业相关人士和读者带来一些启发和帮助。

宏基因组学检测技术

随着核酸测序越来越快速、精准、便宜，全基因组测序已经从一项令人兴奋的技术突破，变成了一件平平无奇的事情。现在，宏基因组测序让研究人员能够同时研究微生物群中所有基因组的集合。这对于了解人类或动物微生物组、诊断感染或监测新出现的病原体极具应用价值。

宏基因组学似乎准备好了从实验室到临床的飞跃。2014 年，第一份案例报告证实了，宏基因组学可以成功地应用于危重患者的诊疗：加州大学旧金山分校（UCSF）的实验室医学和医学/传染病教授 Charles Y. Chiu 博士，带领他的科学团队利用测序技术，在脑脊液样本中检测到了钩端螺旋体，而传统的传染病检查没有发现任何问题。随后，患者接受了合适的抗生素治疗，并康复了。

从那时起，多种宏基因组服务应运而生：UCSF 下一代精准诊断中心可提供脑脊液或血浆样本的宏基因组测序，周期为 1-2 周；Karius 公司提供一种名为 Karius 的检验，该检验可以通过对血浆中的细胞游离DNA进行测序，来检测超过 1000 种病原体，结果通常在一两天后返回；Arc Bio 公司提供一套完全集成的工作流程——Galileo ONE，它与 Illumina 测序仪兼容，无需具备生物信息学专业知识，Arc Bio 公司声称，Galileo ONE 通过分析 DNA 和 RNA，或者同时分析二者，可实现从一个样本中检测和量化超过 99% 的已知人类病原体。

世界各地的实验室和医院都在积极测试临床宏基因组学，并取得了充满希望的结果。

巴黎大学医学教授 Etienne Ruppé 博士说：“这仍然是一个新兴领域，但现在人们普遍认为它是诊断传染病的新兴前沿。”然而，他还提示说：“但是要将其普遍应用于实验室，仍有许多障碍。”

障碍1

全面但费力

诊断微生物学的金标准是分析从病人样本中培养出来的微生物。一种快捷的替代方法是使用 PCR 检测，它可以识别微生物的 DNA 或 RNA。然而，快速分子检测技术仅限于检测候选名单中的病原体。

相比之下，宏基因组测序可以描述样本中所有 DNA 或 RNA 的特征。虽然测序速度不如 PCR 检测快，但它比培养和分析培养物快得多。

当 COVID-19 疫情来袭时，宏基因组学用于诊断弱势人群的院内感染风险的机会出现了。伦敦国王学院临床感染和诊断研究中心（CIDR）主任、病理学家 Jonathan Edgeworth 博士观测到，COVID-19 患者聚集在 ICU 时，医院获得性感染的风险会增加。 

插管和其它干预措施同样使患者面临感染的风险。病原体可以通过未完全消毒的器械在病人之间传播。某些时候，通常一种原本对人体无害的微生物被引入到一个新的环境中，比如肺部或血液时，也会增加感染危险。

往往，临床医生会根据最有可能的猜测给病人使用抗生素，而不是等待分析结果出来后。然而，滥用抗生素可能会导致耐药病原体的产生。

Edgeworth 说：“在你决定用什么样的临床治疗策略的时候，是缺乏全面的微生物学信息指导的。纳米孔测序技术的出现，让我们觉得它有可能提供培养手段所提供的信息。”

纳米孔测序可以实时分析长 DNA 片段，而长序列可以更好地识别物种。“这对我们非常有用，”CIDR 的博士后研究员 Themoula Charalamous 博士强调，“我们希望我们的工作流程尽可能快。我们希望当天得到结果。”

尽管对 20 种或更多物种进行多重 PCR 检测通常就足够了，但如果感染不是由于候选名单中的某一种微生物引起的，它们仍会造成一定程度的不确定性。Edgeworth 坚持说：“当你在重症监护室的时候，这就不够用了。宏基因组学的特点是，它对所有的基因组都进行了测序。这相当于通常需要三天后才能得到的培养物，在当天就给到了你。”

Charalampous和Edgeworth 参与的一项研究表明，纳米孔测序可以高灵敏度地检测真实临床 ICU 环境中的病原体，并预测耐药性。纳米孔工作流程不仅可以在当天提供结果，而且牛津纳米孔技术公司提供的自动化数据分析平台 EPI2ME 还无需生物信息学专家解译结果。

尽管如此，对于广泛的临床应用来说，它还是有点过于劳动密集型了。Charalampous 指出:“这大约需要 8 个小时，其中大部分是手动时间。这需要良好的分子生物学技能。”

障碍2

当心“kitome”

在一项使用纳米孔测序研究中，研究人员有意选择了被临床医生标记为可能感染的患者。Edgeworth 说：“我们不想要太多的阴性结果。这是一项概念验证研究。”

然而，在常规的宏基因组分析中，常常需要加入阴性对照样本，以确定DNA提取试剂盒中存在的微生物，即所谓的 kitome。“当我们对实际上是阴性的样本进行测序时，宏基因组测序也会有细菌信号，”Ruppé 说，“DNA 总是存在。这就是我们所说的 kitome。”

本应无菌的实验器具上还残留着微量的 DNA。更复杂的是，kitome 每次都能产生不同的细菌。对待kitome 不能像忽视一些已知的污染物那么简单。“这对我们来说是一个非常大的挑战，”Ruppé 坚持认为，“在 kitome 中发现的细菌也可能是病原体。”

例如，痤疮丙酸杆菌通常在皮肤上发现，因此它们通常有可能存在于 kitome。然而，“在肩部的骨和关节感染中，它也是一种臭名昭著的病原体。”Ruppé 写道。如果一个可能被感染的肩部样本中的痤疮丙酸杆菌呈阳性，就很难区分真正的阳性和污染物。

这是宏基因组学的一个主要问题。在大多数情况下，传统微生物学技术在成本、广泛的临床验证、广适性和精准诊断大多数典型感染等方面仍然具有优势。至少就目前而言，宏基因组学真正的亮点在于解决某些挑战性的案例，在这些案例中，传统方法无法找到答案。

“当其它所有方法都失败时，临床宏基因组学已经被定位为‘最后有潜力的诊断手段’，”Ruppé 认为，“但如果其它一切都失败了，那么很有可能样本本来就是阴性的，所以你必须认真对待污染物。”

障碍3

区分死活

随着宏基因组技术变得更加自动化和廉价，广泛应用该技术变得更加可行。例如，宏基因组学可以在早期病人护理中发挥优势。“这也是目前临床宏基因组学的遇到的问题之一，”Ruppé 说，“我们是否应该只把它用作最后的测试手段？在早期阶段使用它又有什么好处？”

越来越多的证据表明，临床宏基因组学应该与现有的方法一起考虑，而不仅仅是在其它所有方法都失败之后才考虑它。巴斯大学副研究员 Natacha Couto 博士表示，有许多文献报告表明，宏基因组比培养物更敏感，也有很多报告显示并非如此。然而，Couto 强调，许多研究表明，宏基因组学确实对培养手段所提供的信息进行了补充。

Couto 指出:“有很多例子……宏基因组学发现了仅靠培养无法发现的潜在微生物。就像 PCR 被引入之后，就成为了培养手段的补充，这也会发生在宏基因组学中。”

巴斯大学的 Natacha Couto 预测宏基因组学最终可能成为传统微生物培养的补充手段。下一代测序（NGS）方法比培养方法更快，而 NGS 与 PCR 不同，不需要局限于一组事先选定的目标。宏基因组测序可以快速识别样本中存在的病原体，并检测抗菌耐药基因的存在，为患者治疗提供可操作的信息。

更早地使用宏基因组学可以在感染出现症状之前预防感染，节省资金，缩短住院时间，并减轻病人的压力。辛辛那提儿童医院医疗中心微生物基因组学和宏基因组学实验室主任、儿科医生 David Haslam 博士，看到了宏基因组学在监测抗生素治疗后的易感患者上的应用潜力。

 “微生物组可能会以某种方式变得异常，我们正试图将其作为未来感染的预测因子。”Haslam 说。

他举了一个例子，在一个疗程的抗生素治疗后，病人正常的、多样化的微生物组遭到破坏，一种特殊的大肠杆菌开始占据主导地位。当病人出现严重的血液感染时，测序显示入侵的细菌与占领肠道微生物群的细菌是同一株。

因此，监测肠道微生物群可以为此类细菌感染提供预警。Haslam 补充说，Karius 测试可以在出现任何外部感染之前先用于检测血液中的细菌 DNA。

Haslam 解释说：“（监测微生物群）令人非常兴奋，因为它可能帮助你在病人生病之前采取干预措施。”

Couto 指出，另一个问题是宏基因组学可以提取已经死亡生物体的核酸信号。考虑一个病例，患者感染并开始治疗，但症状仍在继续。她说，即使治疗有效，宏基因组测序也可以从死亡微生物中提取残留的 DNA。Couto 坚持认为，这取决于“临床医生应该要结合所有可用的数据，包括相关症状数据和已使用的实验室方法，以判定是否真的是发生了感染。”

障碍4

区分相似基因和细菌

宏基因组学为我们提供了一种更好的方法来检测抗生素耐药性。“PCR 检测提供了关于抗生素耐药性基因快速而准确的信息，但这些检测只关注少数抗生素耐药性基因，”Haslam 解释说，“理论上，宏基因组学可以研究每一种抗生素耐药性基因。”

然而，他指出，扩大这一范围需要十分谨慎。PCR 检测可以聚焦于与抗生素耐药性密切相关的基因，而宏基因组学可以捕捉不太确定的基因。例如，宏基因组学需要区分具有一定序列相似性但有不同程度抗性的基因家族成员。

 “这主要是生物信息学的挑战和计算的挑战，”Haslam 说，“我认为这是有前途的，不过可能还需要几年时间，但我认为机器学习将是解决这些灰色地带的答案。

另一个这样的灰色地带是区分相似的细菌物种——微小的基因组变化可能意味着无害的共生病原体和危险的病原体之间的区别。使用宏基因组学技术很难将亲缘关系密切的物种分开，因为所有的基因组在样本中都混合在一起。

根据最近的一项研究，来自美国农业部和加州大学圣地亚哥分校的研究人员，通过使用 PacBio 的 HiFi 技术克服了这个问题，这一测序技术可以产生精度大于 99.9% 的长读长序列。当研究人员使用这项技术对绵羊粪便的宏基因组进行测序时，他们能够组装真正完整的细菌基因组，而不会被高度重复的片段困住。他们使用高通量染色体构象捕获（Hi-C）技术对重叠群（contigs）进行分类，然后使用一种 MAGPhase 的算法来解析密切相关的单倍型。

最终，该研究确定了 428 个基因组，其完整性超过 90%，其中 44 个是单个环状 contigs。这些发现表明，一个完整的宏基因组流程可以成功地评估许多宏基因组，包括人体宏基因组。

该研究的领导者之一，加州大学圣地亚哥分校计算机科学教授 Pavel A. Pevzner 博士表示，宏基因组技术可以帮助我们应对像 2011 年德国爆发的大肠杆菌疫情等情况。

他回忆说：“对引起疫情的致病性大肠杆菌进行测序并不那么容易。我相信，如果未来有细菌疫情爆发，人们肯定会使用这种宏基因组方法来定义致病物种。与疫情可能造成的数十亿美元损失相比，这一成本微不足道。”

Pevzner 宣称：“宏基因组学正在进入一个新时代。我们的研究只是一个信号，告诉大家这个新时代已经到来。”

原文链接：

https://www.genengnews.com/topics/omics/metagenomic-sequencing-moves-to-the-clinic/

作者｜Caroline Seydel

编译｜萌萌依

审校｜617

编辑｜豫小鱼

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